서 론
재료 및 방법
시험 재료 및 EMS 처리
EMS 유도 내염성 증진 계통 선발
내염성 계통 표현형 조사
기공전도도 측정
Proline 함량 측정
내염성 반응 유전자 발현 분석
염기서열재분석(Whole-genome re-sequencing)과 SNP 분석
데이터 분석
결과 및 고찰
EMS 처리를 위한 적정 농도 선정
내염성 옥수수 돌연변이체 집단 선발
내염성 선발 계통의 발아 및 생육 조사
140ES91의 내염성 조사
140ES91의 유전변이 분석
내염성 관련 유전자 발현 분석
적 요
서 론
옥수수(Zea mays L.)는 벼, 밀과 함께 세계 3대 작물로써 환경 적응 범위가 넓어 전세계적으로 다양한 토양과 환경에서 재배되고 있다. 옥수수는 식량과 가축의 사료뿐만 아니라 바이오연료의 원료 등 농산업적 측면에서 다양한 용도로 활용되고 있다(Edgerton, 2009; Khatoon et al., 2010). 옥수수의 성장과 발달, 생산력은 가뭄(Nepolean et al., 2018)과 염분(Farooq et al., 2015; Sun et al., 2018)과 같은 비생물적 스트레스에 심각하게 영향을 받고있다. 특히 옥수수는 염분 스트레스에 민감한 작물로써(Chinnusamy et al., 2005) 벼보다는 내성을 가지고 있으나 보리, 수수, 밀 그리고 듀럼 밀보다는 약한 작물이다(Mass & Hoffman, 1977). 따라서 염분 내성은 옥수수 재배를 위해 고려해야 할 가장 중요한 요인 중 하나이다(Falcon & Naylor, 1998).
염분은 세계적으로 농업 생산성을 저해하는 주요 비생물적 스트레스 요인 중 하나이다(Zhu, 2001). 과도한 화학비료 및 퇴비의 사용, 급격한 환경 변화 등 다양한 요인들에 의한 토양의 염류집적 현상은 지속 가능한 식량 생산의 심각한 위협 요인이 되고있다(Munns & Tester, 2008; Ondrasek et al., 2011). 전세계 경작지의 약 20%와 관개 농지의 약 30%가 높은 염분으로 인해 작물의 재배가 어려우며, 매일 약 2,000 ha 경작지가 염분으로 인해 경작지로써 기능이 상실되는 것으로 추정된다(FAO, 2015; Shrivastava & Kumar, 2015).
높은 염분 농도는 작물의 성장과 발달을 저해함으로써 심각한 생산성 손실을 유발한다. 염분은 발아와 생식생장기 및 영양생장기 성장을 저해하며 영양분의 불균형을 유발한다(Shrivastava & Kumar, 2015; Sandhu & Kaundal, 2018). 뿌리를 통한 Na+와 Cl-의 과도한 흡수는 이온 불균형을 유발하여 산화 스트레스를 일으키며(Zhu, 2002), 이는 K+ 및 Ca+과 같은 필수 무기질 성분의 감소로 인해 식물의 성장에 악영향을 미치게 된다(Lutts et al., 1999). 또한 식물의 조직 발달을 방해함으로써 잎 발달 장애를 유발하여 광합성 효율을 저해하며(Sayed, 2003; Wang et al., 2003) 이는 종실의 크기, 무게 그리고 포도당 및 전분 함량의 감소로 이어진다(Hiyane et al., 2010; Schubert, 2011).
식물은 염분 스트레스에 반응하여 세포 및 기관 수준에서 기공 개폐 조절, 호르몬 균형 조절, 항산화 방어 시스템 활성화, 삼투압 조절 및 독성 이온의 제거와 같은 다양한 메커니즘을 통해 반응한다(Kaya et al., 2010; Farooq et al., 2015). 식물 세포 내 삼투 조절제인 proline의 축적은 효과적인 내염성 지표로 활용된다. Proline은 염분 스트레스에 노출된 식물 세포 내에서 삼투압 조절, 세포막 안정화 및 유해한 이온의 해독 과정에 관여하는 것으로 보고되어 있다(Hare et al., 1999; Kavi Kishor et al., 2005; Ashraf & Foolad, 2007). 염분 스트레스에 방어기작으로써 식물체 내 proline 증가는 외부에서의 처리(Santos et al., 1996; Hoque et al., 2007; Kaya et al., 2007), 생합성 유전자의 과발현(Zhu et al., 1998; Han & Hwang, 2003) 및 분해 유전자의 결실(Nanjo et al., 1999)과 같은 다양한 방법들이 존재한다. 염분 스트레스를 받은 옥수수에 삼투 조절제인 glycine betaine 처리 시 기공 전도도의 효율이 개선되며 이를 통해 광합성이 증대됨으로써 식물의 성장을 향상시킨다(Yang & Lu, 2005). 이와 더불어 다양한 스트레스 반응 유전자들의 발현 조절을 통해 염분과 건조 등 다양한 환경 스트레스에 반응한다(Gupta & Huang, 2014). 애기장대에서 옥수수 ABP9 과발현 식물체는 ABA 신호 전달 및 세포 내 활성 산소 조절을 통해 스트레스 내성을 부여하며(Zhang et al., 2011), 칼슘 신호전달에 관여하는 CIPK21은 염분 스트레스 내성을 부여한다(Pandey et al., 2015). 또한 야생잔디에서 BdCIPK31은 기공 세포의 개폐 조절과 염분 스트레스 관련 유전자들의 발현을 조절함으로써 건조와 염분 스트레스에 내성을 부여한다(Luo et al., 2017).
유전자의 생물학적 기능을 결정하는 접근 방법 중 하나로 표현형과 생리적 반응을 변화시키는 돌연변이 유발이 있다. 돌연변이 유발을 위한 화학적, 물리적 방법을 포함하는 다양한 방법들이 고안되었으며, 각각의 방법은 유전자 기능 연구에 장단점을 가지고 있다(Kim et al., 2006). EMS는 종자 돌연변이에 자주 사용되는 돌연변이원으로 효과적이고 높은 빈도로 돌연변이를 유도하며, 그 중 일부는 정지 코돈으로 이어진다(Talebi et al., 2012; Chen et al., 2013). 이러한 효과와 더불어 다른 화학 돌연변이원에 비해 상대적으로 다루기 용이하며 사용 후 가수분해를 통해 제독함으로써 손쉽게 처리할 수 있다(Pathirana, 2011). EMS 유도 돌연변이는 차세대 염기서열 분석과 TILLING (Targeting Induced Local Lesion IN Genome)과 같은 방법을 통해 확인할 수 있다.
본 연구에서는 우리나라 우량 옥수수 자식계통인 KS140에 EMS를 처리하여 내염성 증진 옥수수 돌연변이 계통을 선발하고, 염분 스트레스에 대한 내염성 옥수수의 형태학적, 생물학적 반응 및 유전 변이를 분석하여 옥수수의 염분 스트레스 관련 기작을 규명하고자 하였다.
재료 및 방법
시험 재료 및 EMS 처리
본 연구에서는 국립식량과학원에서 육성한 사료용 옥수수 자식계통인 KS140 (우량 교잡계 품종 ‘강다옥’의 모본)을 사용하였다. 내염성 증진 돌연변이 집단을 육성하기 위한 EMS 적정 처리 농도를 결정하기 위해 KS140 종자 20개를 12시간 물에 불린 후 0, 0.5, 0.7% 농도의 EMS (Sigma, St. Louis, MO)로 실온, 암상태에서 0, 8 및 12시간 처리한 후 EMS 반응 정지를 위해 10% sodium thiosulfate solution을 15분간 처리하였다. 이 후 멸균수로 2번 세척하여 반응을 중지하였고, 종자의 중화 반응을 위해 12시간 동안 흐르는 물로 세척하였다. EMS 처리 후 종자 발아율과 초장을 조사하여 돌연변이 유발을 위한 적정 농도를 선정하였다. 발아율 조사를 위해 종자 소독 후 agar 배지에 치상하여 기내 배양실 25°C, 광주기 16/8시간(광/암) 조건에서 7일간 배양하였고, 초장을 조사하기 위해 50공 포트에 파종하여 온실에서 3주간 생육 후 일주일 간격으로 생육 상태를 조사하여 적정 농도를 선정하였다.
EMS 유도 내염성 증진 계통 선발
내염성 증진 계통 집단을 확보하기 위해 약 3,000립의 KS140 종자에 0.5% EMS를 12시간 처리하여 돌연변이를 유발하였다. 내염성 증진 계통 선발을 위해 종자를 파종 후 자가 교배를 통해 세대를 진전하여 1,471 계통의 M1 집단을 확보하였다. M1 집단을 자가 교배 후 세대를 진전하여 최종 203 계통의 M3 집단을 확보하였고, 자가 교배를 통해 후세대 종자를 확보하였다. 내염성 증진 계통 선발을 위해 각 계통의 종자를 50공 포트에 파종 후 0.7% NaCl을 처리하여 온실에서 3주간 재배하였다. 염 처리 3주후 대조군과 비교하여 양호한 생육상태를 보이는 내염성 계통을 선발하였다. 선발된 내염성 계통을 이용하여 기내 생육 특성 검정 및 재염기서열분석을 수행하였다.
내염성 계통 표현형 조사
기내 선발된 내염성 계통 140ES91 돌연변이체에서 염분 스트레스 처리에 따른 생육 상태를 조사하기 위해 대조군인 KS140과 140ES91 종자를 하루 동안 물에 불린 후 0.5% NaCl이 첨가된 배지에 파종하였다. 초장 및 근장은 기내 파종 10일 후 조사하였다.
기공전도도 측정
염분 스트레스 처리에 따른 기공전도도를 조사하기 위해 대조군인 KS140과 140ES91을 온실에서 한 달간 배양하여 0.5% NaCl을 일주일 간격으로 3주간 처리 한 후 6~8엽을 이용하여 기공전도도를 측정하였다. 기공전도도는 휴대용 장치 SC-1 Leaf Porometer (ICT, New South Wales, AU)를 사용하여 잎의 뒷면에서 확산되는 수분을 측정하였다(Cho et al., 2019).
Proline 함량 측정
염분 스트레스 시 식물체 내 축적되는 proline 함량을 조사하기 위해 대조군 KS140과 140ES91을 0.5% NaCl이 첨가된 배지에 파종 후 기내 배양실에서 10일간 배양하였다. 염분 스트레스 처리 후 식물 전체를 액체질소를 이용해 분쇄하였고 20% 에탄올 1 ml 첨가하여 잘 섞어준 후 14,000× g로 5분간 원심분리 하였다. 상층액 10 μℓ를 isatin 여과지(Isatin 1 g, 100 ml methanol, 2.5 ml glacial acetic acid)에 떨어뜨린 후 상온, 암 상태에서 30분간 건조하였다(Boctor, 1971). 이 후 90°C 오븐에서 20분간 isatin과 proline을 반응 시킨 후 발색 정도를 확인하였다. 염색의 정도를 확인하기 위해 L-Proline (Sigma, St. Louis, MO)을 이용하여 표준 곡선을 작성하였고, ImageJ (NIH, Maryland, USA) 프로그램을 이용하여 염색의 강도를 정량하였다(Ábrahám et al., 2010).
내염성 반응 유전자 발현 분석
염분 스트레스 처리에 의한 140ES91 식물체에서 내염성 관련 유전자의 발현 양상을 조사하기 위해 Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) 분석을 수행하였다. KS140과 140ES91 돌연변이 식물체를 0.5% NaCl이 첨가된 배지에 파종하여 기내배양실에서 일주일간 배양하였다. 이후 식물 전체를 이용하여 액체 질소로 분쇄하였고, RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, DE)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 NanoVueTM Plus (GE healthcare, Illinois, USA)를 이용하여 정량하였으며, DNA to cDNA EcoDryTM Premix (Oligo dT) kit (Takara, Moriyama, JP)를 이용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 유전자 발현 분석에 사용한 프라이머는 NCBI Primer-BLAST를 이용하여 제작하였다. 유전자 증폭을 위한 프라이머로 ABP9-F: 5′-ATGTGGTCTC AGATACCCGGCACC-3′, ABP9-R: 5′-GTTCCT CCTCT CAATCCTCTTCTTCTTAAC-3′, CIPK21-F: 5′-GCACTTGA AATCACTTGGATATATTGTTGGA-3′, CIPK21-R: 5′-CATT GGAGGCCCCATCAACTCTATTTAA-3′, CIPK31-F: 5′-ATG TATCGGGCTAAGAGGGCTGCATTGT-3′, CIPK31-R: 5′-GA TAGCAACAGGTTCCCCGTTTTCAGTGTT-3′, ACTIN-F: 5′-TGTGTTGGACTCTGGTGATGGTGT-3′, ACTIN-R: 5′- TGATGTCCCGTACGATTTCCCGTT-3′를 사용하였다. Quantitative RT-PCR은 TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) (Takara, Moriyama, JP)를 사용하여 수행하였다.
염기서열재분석(Whole-genome re-sequencing)과 SNP 분석
EMS 처리에 의해 유발되는 유전 변이를 탐색하기 위해 전체 게놈 염기서열 재분석(Whole-genome re-sequencing)을 수행하였다. 대조군 KS140과 140ES91을 기내 배양실에서 일주일간 배양한 후 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, DE)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 Illumina HiSeq X 장비를 사용하여 염기서열을 분석하였고, 생산된 염기서열 정보로부터 low quality 서열과 중복된 서열을 Trimmomatic (version 0.38)을 이용하여 제거하였다. 선발된 염기서열들은 옥수수 inbred line B73의 표준 유전체 서열(http://plants.ensembl.org/ Zea_mays/Info/Index, B73_RefGen_v4, database version 90.7)에 Burrows-Wheeler Aligner (BWA, version 0.7.17)을 이용하여 맵핑하였다. 이후 맵핑 결과를 SAMtools (version 1.9)을 이용하여 BAM 형식으로 변환하고, Picard package (version 1.112, http:// broadinstitute.github.io/picard/)를 이용하여 중복된 서열들을 제거하였다. Genome Analysis Toolkit (GATK, version 3.5)의 HaplotypeCaller module을 이용하여 변이를 선발하고 VCF 파일을 작성하였다. 이 파일로부터 유의미한 SNP를 min coverage, 5; max coverage, 250; min quality, 20; SNP ratio, >=0.8-0.9 parameter를 적용하여 선발하였다. KS140과 140 ES91을 표준 유전체 B73과 맵핑하여 발굴한 유전형 결과를 최종 비교하여 KS140으로부터 발생한 140ES91의 유전변이를 탐색하였다.
데이터 분석
모든 시험은 3반복 수행하여 결과를 획득하였으며, 각각의 결과에 대한 통계 분석은 SPSS 통계 패키지 23 (SPSS Inc., Illinois, USA)를 이용하였다. 통계적 검증은 Student t-test와 분산 분석을 수행하였으며, 사후 검정은 터키 검증(Tukey’s HSD)을 사용하여 p 값이 0.05 이하인 경우를 유의한 차이가 있는 것으로 판단하였다.
결과 및 고찰
EMS 처리를 위한 적정 농도 선정
EMS 독성으로 인한 종자의 손실없이 높은 돌연변이율을 달성하는데 필요한 EMS 적정 농도를 결정하기 위해 다양한 농도와 시간 조건에서 생육 상태를 조사하였다. EMS 적정 농도를 결정하기 위해 KS140 종자에 0, 0.5 및 0.7%의 EMS를 각각 8시간과 12시간 처리하여 발아율 및 초장을 조사하였다(Fig. 1). 발아율은 EMS 0.5와 0.7% 농도 조건에서 처리 시간에 상관없이 대조군과 유사한 양상을 보였다. 반면 생육 상태는 EMS 처리 시간과 생육 기간에 따라 0.5와 0.7% 농도 조건 모두에서 지연되는 것을 확인하였다. 두 농도 조건 모두에서 발아 후 일주일부터 생육에 차이를 보였으며 생육 3주 이후까지 생육 지연을 보였다. 3주 후 생육 상태는 EMS 8시간 처리 조건에서 0.5% 농도에서는 대조군(43.82 mm) 대비 약 13% (37.81 mm), 0.7% 농도에서는 약 23% (33.71 mm)의 생육 지연율을 보였으며, 12시간 처리한 조건에서는 대조군(39.93 mm) 대비 0.5% 농도에서 약 20% (32.21 mm) 그리고 0.7% 농도에서는 약 40% (25.01 mm)의 초장이 감소함을 확인하였다. 따라서 발아율에 영향을 미치지 않으면서 생육에 큰 지장을 초래하지 않는 0.5% EMS 농도와 처리 시간 12시간을 돌연변이 유발 조건으로 선정하였다.
내염성 옥수수 돌연변이체 집단 선발
내염성 증진 옥수수 돌연변이체 집단을 육성하기 위해 KS140 종자 3,000립에 0.5% EMS를 12시간 처리하였다. EMS 처리 후 포장에 파종하여 발아 및 생육 상태가 불량한 개체를 제외하고 자가 교배 후 1,471 계통의 M1 종자를 수확하였다. 후세대 종자 상태가 양호한 계통들을 파종하여 2~3개월 후 자가 교배를 통해 997 계통의 M2 종자를 확보하였고, inbred 계통을 육성하기 위해 M2 계통을 자가 교배하여 203개의 M3 계통을 확보하였다. 확보된 M3 종자에서 내염성 증진 계통을 선발하기 위해 온실 내 50공 포트에 종자 파종 후 0.7% NaCl을 3주간 처리하였다. 염 처리 후 대조군 대비 생육이 양호한 계통들을 선발하였고, 그 중에서 가장 양호한 생육 상태를 보이는 140ES91 계통을 최종 선발하여 M7 세대까지 진전하였다(Fig. 2).
내염성 선발 계통의 발아 및 생육 조사
옥수수는 염 스트레스에 민감하여 뿌리와 신초 생장이 각각 20%와 50% 이상 저해된다고 보고되어 있다(Geilfus et al., 2010). 그러나 EMS 처리 돌연변이 유도 사료용 옥수수 돌연변이체들 중 내염성이 증진된 계통이 선발되어 이에 대한 내염성 증진 실험을 수행하였다. 선발된 내염성 140ES91 계통을 이용하여 기내 배양실 조건에서 염분 스트레스 처리 후 식물의 초장 및 근장을 조사하였다(Fig. 3). 염분 스트레스가 없는 조건에서 140ES91은 초장과 뿌리 발달 모두 KS140과 유사한 생육상태를 보였다. 그러나 0.5% 염 처리 후 KS140의 초장은 정상 조건(8.3 cm) 대비 약 45% 감소한 4.8 cm를 보였으며, 이는 무처리구(7.5 cm) 대비 약 22% (5.8 cm) 감소한 140ES91에 비해 현저한 생육 저해를 보였다. 근장 또한 무처리구와 비교하여 KS140은 약 42% 감소한 4.8 cm를 보인 반면 140ES91은 무처리구 대비 22%가 감소한 6.6 cm로 조사되었다. 상기 실험 결과들로부터 140ES91은 염분 스트레스에 조건에서 초장과 뿌리 발달을 촉진시킴으로써 염분 스트레스에 대한 내성을 부여할 것으로 판단된다(Geilfus et al., 2010).
Fig. 3
Phenotype analysis of KS140 and 140ES91 after salt stress. (A) Morphological phenotype of KS140 and 140ES91 after 0.5% NaCl treatment. Stem length (B) and root length (C) of KS140 and 140ES91 after in response to salt stress. Data are means ±SD determined from three independent biological replicates. Asterisks denote statistical significance at p < 0.01 (**) by Student’s t-test. Scale bar: 1 cm.
140ES91의 내염성 조사
염분에 노출된 식물은 세포 내 proline을 축적함으로써 내염성에 관여한다고 알려져 있다(Hare et al., 1999; Kavi Kishor et al., 2005; Ashraf & Foolad, 2007). 140ES91 돌연변이체의 내염성을 조사하기 위해 염분 스트레스 처리 후 proline 함량을 조사하였다(Fig. 4A). KS140과 140ES91을 0.5% NaCl이 첨가된 배지에 파종하여 10일간 기내 배양실에서 배양 후 isatin 분석법으로 proline 함량을 조사하였다. 무처리구에서 KS140과 140ES91의 proline 함량은 유사한 수준을 보였으나, 염분 스트레스 처리 후 140ES91은 대조군(0.9 μg/mg) 대비 약 36% 증가한 1.12 μg/mg의 proline 함량을 보였다. 또한 Chaves et al. (2009)는 다양한 환경 스트레스에 의한 기공의 폐쇄는 광합성 저하를 야기하여 식물의 생육을 저해한다고 보고하였다. 염분 스트레스 상에서 140ES91의 광합성 능력을 확인하기 위해 기공전도도를 조사하였다(Fig. 4B). 온실에서 한달 간 배양한 식물체에 0.5% NaCl을 처리한 후 일주일 간격으로 기공전도도를 측정하였다. 무처리구에서는 KS140과 140ES91의 기공전도도는 차이를 보이지 않았으나, 염분 스트레스 처리 일주일부터 3주 후까지 두 식물체 모두에서 기공전도도가 비슷한 비율로 감소하였다. 염분 스트레스 처리 3주 후 KS140은 0.09 mol/m2·s의 기공전도도를 보인 반면 140ES91은 0.15 mol/m2·s로 1.5배 높은 기공전도도를 보였다. 또한 2일간 회복한 식물체에서 기공전도도를 측정한 결과, KS140의 0.15 mol/m2·s 기공전도도와 비교하여 140ES91은 0.21 mol/m2·s의 높은 기공전도도를 보였다. 다양한 식물체에서 내염성과 proline 함량은 정의 상관관계를 보이며(Ashraf & Foolad, 2007), 수분 스트레스 시 과산화수소 처리에 의한 기공의 개방을 통해 식물의 생육을 촉진시킨다(Yordanov et al., 2000). 따라서 140ES91은 염분 스트레스에 반응하여 세포 내 proline을 축적하고 높은 광합성 효율을 유지함으로써 염분 스트레스에 대한 저항성을 획득한 것으로 판단된다.
Fig. 4
Effect of salt stress on proline contents and stomatal conductance of KS140 and 140ES91. Proline contents (A) and stomatal conductance (B) of KS140 and 140ES91. Data are means ±SD determined from three independent biological replicates. Different letters indicate a significant difference determined by one-way ANOVA followed by Tukey’s post hoc test (p < 0.05).
140ES91의 유전변이 분석
식물은 고착 생물로써 주변 환경과 다양한 상호작용을 한다. 자연계에서 유전적 변이로 발생하는 돌연변이는 이러한 주변 환경에 적응하기 위한 다양한 능력을 강화시켜 왔다(Mickelbart et al., 2015). EMS 유도 내염성 증진 돌연변이체 140ES91의 유전변이 탐색을 위해 전체 게놈 염기서열배분석(Whole genome re-sequencing)을 수행하였다. 염기서열재분석 결과를 통해 140ES91에서 유전자간(intergenic) 영역에서 1,024개와 유전자(genic) 영역에서 150개의 SNPs 및 InDels을 포함하는 유전변이가 확인되었다(Fig. 5). 유전자 영역 유전변이 중 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 exon 영역에서 55개, intron 영역에서 71개, 그리고 비번역 영역(UTR)에서 24개의 변이가 확인되었다. 그 중 exon 영역에서 아미노산 서열의 변화를 유발하는 non-synonymous 변이는 39개로 1번 염색체에서 9개, 2번 염색체에서 5개, 3번 염색체에서 2개, 4번 염색체에서 1개, 5번 염색체에서 4개, 6번 염색체에서 8개, 7번 염색체에서 7개, 8번 염색체에서 2개, 10번 염색체에서 1개가 확인되었다(Table 1). 유전변이 분석을 통해 아미노산 변이를 유발하는 다양한 유전자들이 확인되었으나 옥수수에서 염분 스트레스 내성을 증가시키기 위한 내염성 관련 유전자는 명확히 밝혀져 있지 않다. 따라서 본 연구에서 확인된 유전자의 변이와 내염성 관련 메커니즘 규명을 위한 유전자 기능 탐색 등의 연구가 필요할 것으로 판단된다.
Fig. 5
Annotation of SNPs and InDels identified between KS140 and 140ES91. SNPs and InDels were classified as genic and intergenic based on the annotations of B73 reference genome (http://plants.ensembl.org/Zea_mays/Info/Index, AGPv4, RefGen_v4). The numbers and proportions of mutations are shown on the graph.
Table 1.
List of non-synonymous variants identified through re-sequencing in 140ES91 salt-tolerant line.
| *Chr | Nucleotide Change | Amino acid Change | Gene ID | Gene Description |
| 1 | C > T | Ser > Phe | Zm00001d027317 | ZmHB58, rolled leaf 2 (rld2) |
| 1 | G > A | Arg > His | Zm00001d027449 | Unknown |
| 1 | G > C | Ala > Gly | Zm00001d028207 | ATP synthase subunit gamma mitochondrial |
| 1 | C > T | Gly > Asp | Zm00001d028222 | Zinc finger protein 8 |
| 1 | C > T | Arg > Lys | Zm00001d028332 | Coatomer subunit gamma |
| 1 | C > T | Ala > Thr | Zm00001d029096 | Unknown |
| 1 | C > T | Asp > Asn | Zm00001d029462 | Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain-related |
| 1 | C > T | Ala > Thr | Zm00001d030069 | Homeodomain leucine zipper family IV protein |
| 1 | C > T | Arg > His | Zm00001d030759 | Lectin-like receptor kinase 7 |
| 2 | G > A | Ala > Thr | Zm00001d002867 | Ethylene-responsive transcription factor ERF053 |
| 2 | G > A | Ser > Phe | Zm00001d003252 | Glucose-6-phosphate dehydrogenasel |
| 2 | G > A | Ala > Thr | Zm00001d003390 | Acyl-CoA-sterol O-acyltransferase 1 |
| 2 | G > A | Ala > Thr | Zm00001d004925 | DDT domain-containing protein PTM |
| 2 | G > A | Ala > Thr | Zm00001d005653 | Unknown |
| 3 | A > T | Leu > Gln | Zm00001d039282 | Serine/threonine-protein kinase AGC1-5 |
| 3 | G > A | Glu > Lys | Zm00001d039318 | Probable membrane-associated kinase regulator 2 |
| 4 | C > T | Arg > Lys | Zm00001d052450 | Pentatricopeptide repeat-containing protein |
| 5 | C > T | Glu > Arg | Zm00001d016512 | Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP65 |
| 5 | C > T | Arg > Cys | Zm00001d016807 | Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 3 |
| 5 | C > T | Ser > Leu | Zm00001d016851 | Unknown |
| 5 | C > T | Val > Ile | Zm00001d016928 | Somatic embryogenesis receptor kinase 2 |
| 6 | G > A | Met > Ile | Zm00001d035333 | Pentatricopeptide repeat-containing protein mitochondrial |
| 6 | G > A | Pro > Leu | Zm00001d035757 | Vacuolar sorting protein 39 |
| 6 | G > A | Arg > Cys | Zm00001d036571 | Heat shock 70 kDa protein 16 |
| 6 | G > A | Cys > Tyr | Zm00001d036949 | Serine/threonine-protein phosphatase PP2A-5 catalytic subunit |
| 6 | G > A | Leu > Phe | Zm00001d037465 | Putative phospholipid-transporting ATPase 9 |
| 6 | C > A | Ala > Ser | Zm00001d038019 | Ribosomal protein-like |
| 6 | G > A | Val > Ile | Zm00001d038137 | Germin-like protein subfamily 2 member 1 |
| 6 | C > T | Val > Ile | Zm00001d039214 | Argonaute104 |
| 7 | G > A | Gly > Arg | Zm00001d019195 | Histone-lysine N-methyltransferase H3 lysine-9 specific SUVH3 |
| 7 | G > A | Ala > Val | Zm00001d020768 | Barren stalk fastigiate1-related-1%3B DNA-binding protein |
| 7 | G > A | Pro > Leu | Zm00001d020957 | NAD(P)-binding Rossmann-fold superfamily protein |
| 7 | G > A | Val > Ile | Zm00001d020958 | Dihydroflavonol-4-reductase |
| 7 | G > A | Asp > Asn | Zm00001d021343 | Pentatricopeptide repeat-containing protein |
| 7 | G > A | His > Tyr | Zm00001d021956 | Probable amino-acid acetyltransferase NAGS1 chloroplastic |
| 7 | G > A | Arg > His | Zm00001d022003 | Pentatricopeptide repeat-containing protein |
| 8 | G > A | Ala > Val | Zm00001d008296 | Phytochrome kinase substrate 1 |
| 8 | G > A | Gly > Arg | Zm00001d008733 | ABC transporter C family member 3 |
| 10 | G > T | Leu > Phe | Zm00001d025044 | Vacuolar protein sorting-associated protein 54 chloroplastic |
내염성 관련 유전자 발현 분석
식물은 염분 스트레스에 반응하여 특정 유전자 산물의 증가나 감소를 조절하는 다양한 메커니즘을 통해 내염성을 부여한다(Gupta & Huang, 2014). 140ES91에서 내염성 반응 유전자들의 발현 양상을 조사하기 위해 염분 스트레스 처리 후 qRT-PCR 분석을 수행하였다(Fig. 6). 무처리구에서 ABP9와 CIPK31은 KS140 대비 140ES91에서 높은 발현양을 보였으며, 염분 스트레스 처리 후에도 높은 발현양을 유지하였다. CIPK21은 무처리구에서 KS140과 140ES91 간 큰 차이를 보이지 않았으나, 염분 스트레스 처리 후 KS140에서는 발현이 감소한 반면 140ES91에서는 무처리구와 유사한 발현양을 유지하였다. 애기장대에서 옥수수의 ABP9 유전자의 과발현은 내염성을 부여하며(Zhang et al., 2011), CIPK2 유전자의 결실은 염분 스트레스에 취약한 특성을 나타낸다(Pandey et al., 2015). 또한 담배에서 CIPK31 유전자의 과발현은 건조 및 염분 스트레스 내성에 관여한다(Luo et al., 2017). 따라서 140ES91의 내염성은 염분 스트레스에 반응하는 유전자들의 발현양과 관련이 있을 것으로 추정된다.
Fig. 6
qRT-PCR analysis of salt stress responsive genes in KS140 and 140ES91. For salt stress treatment, each seeds were sown in medium with or without 0.5% NaCl. Data are means ±SD determined from three independent biological replicates. Different letters indicate a significant difference determined by one-way ANOVA followed by Tukey’s post hoc test (p < 0.05). ABP, ABA-responsive- element-binding protein 9; CIPK21, CBL-interacting protein kinase 21; CIPK31, CBL-interacting protein kinase 31.
적 요
본 연구는 간척지 내 재배 가능한 내염성 사료용 옥수수를 선발하기 위해 EMS를 이용하여 돌연변이 집단을 구축하고 기내 선발 방법을 통해 내염성 증진 계통을 선발하였고, 연구결과는 다음과 같다.
1. 사료용 옥수수 모본인 KS140에 다양한 조건으로 EMS를 처리하여 발아율 및 식물의 생육 상태를 조사하였고, 발아율에는 영향을 미치지 않으면서 생육에 큰 영향을 주지않는 0.5% EMS를 돌연변이 유도 적정 농도로 선정하였다.
2. 기내 선발 방법을 통해 선발된 내염성 증진 계통 140ES91 계통을 이용하여 0.5% 염분 스트레스 처리 후 표현형을 조사한 결과, 대조군인 KS140 대비 식물의 초장 및 근장의 생육이 양호하였으며, 높은 proline 함량과 기공전도도를 보였다. 따라서 염분 스트레스 시 높은 proline 함량과 기공전도도가 140ES91 계통의 증가된 내염성과 관련이 있을 것으로 판단된다.
3. 내염성 증진 140ES91 계통의 유전변이 분석을 통해 유전자 기능에 영향을 미칠 수 있는 아미노산 변이를 유발하는 39개의 변이 유전자를 확인하였고, 변이 유전자와 내염성의 관계를 증명하기 위한 유전자 기능 분석이 요구된다.
4. 기 보고된 내염성 관련 유전자들의 발현 양상을 조사한 결과 ABP9과 CIPK31 유전자는 대조군 대비 염분 스트레스 처리 전후 140ES91 계통에서 높은 발현율을 보였으며, CIPK21 유전자는 염분 스트레스 처리 후 대조군에는 발현이 감소하나 140ES91 계통에서는 발현이 유지됨을 확인하였다. 따라서 140ES91 계통에서 보이는 내염성 관련 유전자들의 높은 발현율이 140ES91 계통의 내염성에 관여할 것으로 판단된다.
5. 이상의 결과 기내 선발 방법을 통해 선발한 내염성 증진 계통은 간척지와 같은 염류집적 토양에서 작물의 안정적인 재배와 생산이 가능한 내염성 증진 품종 개발의 육종 소재로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
